1. 冷凍保種實驗服務內容概述
A. 適用樣本類型
微生物：細菌（如大腸桿菌、乳酸菌）、酵母（如畢赤酵母）、絲狀真菌、噬菌體等。
細胞系：哺乳動物細胞（如HEK293、HeLa）、干細胞、原代細胞等。
特殊樣本：難培養微生物（如厭氧菌）、基因編輯菌株（如CRISPR改造菌）。
B. 服務項目
| 項目 | 描述 |
|---|---|
| 標準凍存 | 使用甘油或DMSO凍存液，-80℃或液氮保存。 |
| 優化凍存方案 | 針對脆弱菌種（如支原體）定制凍存保護劑。 |
| 復蘇驗證 | 凍存后復蘇，檢測存活率、污染及功能（如質粒保留、基因表達）。 |
| 庫存管理 | 提供條形碼標簽、電子數據庫記錄（凍存時間、位置、基因型等）。 |
| 快遞運輸 | 干冰或液氮罐運輸凍存管，確保全程低溫。 |
2. 冷凍保種實驗服務技術流程
A. 標準凍存步驟（以大腸桿菌為例）
前處理：
培養至對數生長期（OD600≈0.6-0.8）。
離心收集菌體，去除殘留培養基（避免冷凍損傷）。
凍存液制備：
常用保護劑：15-30%甘油（細菌）或10% DMSO（哺乳細胞）+培養基。
特殊配方：如海藻糖（提高真菌存活率）。
分裝與標記：
分裝至凍存管（推薦1.5 mL螺口凍存管），標注菌株名稱、日期、濃度。
冷凍程序：
梯度降溫：4℃ 30 min → -20℃ 1 h → -80℃長期保存（或直接液氮氣相）。
程序冷凍儀：精確控制降溫速率（如1℃/min，適用于敏感細胞）。
液氮保存：
轉移至液氮罐（氣相：-150℃至-196℃），避免液相中管爆裂。
B. 復蘇驗證
快速解凍（37℃水浴，<1 min）。
涂板或液體培養，檢測：
存活率（CFU計數 vs 凍前）。
遺傳穩定性（PCR驗證目標基因、質粒保留率）。
污染檢測（無抗生素平板培養、16S rRNA測序）。
3. 關鍵注意事項
A. 提高存活率的策略
保護劑優化：
細菌：甘油濃度需匹配菌種（如乳酸菌需20%甘油+5%脫脂奶粉）。
細胞：血清替代物（如HyClone FBS）減少批次差異。
冷凍速率：
快速冷凍（直接-80℃）適合多數細菌，慢速冷凍（程序降溫）適合真核細胞。
B. 避免常見問題
| 問題 | 原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 復蘇后無生長 | 保護劑濃度不當或凍存液未混勻 | 重新優化保護劑，渦旋混勻后再凍存。 |
| 細胞破裂 | 冰晶形成（降溫過慢） | 添加冷凍保護劑（如DMSO），程序降溫。 |
| 污染（真菌/支原體） | 凍存前樣本不純或操作污染 | 凍存前抗生素處理、PCR檢測。 |
4. 用戶常見問題（FAQ）
Q1：凍存菌種能保存多久？
-80℃：細菌通常2-5年，酵母1-3年（定期復蘇驗證）。
液氮：>10年（需避免溫度波動）。
Q2：如何運輸凍存菌種？
干冰運輸：維持-78℃，適合短期（<3天）。
液氮罐：長期運輸需專業容器（如Taylor-Wharton液氮罐）。
Q3：凍存后基因會突變嗎？
風險較低，但建議：
保存早期傳代菌株（避免累積突變）。
關鍵菌株備份多管（避免反復凍融）。
6. 延伸服務
菌種鑒定：16S rRNA測序、MALDI-TOF質譜分析。
專l保藏：協助提交至中國典型培養物保藏中心（CCTCC）或ATCC。
